這一回，他把鬥爭的矛頭直接指向了當今皇上。
嘉靖四十五年（西元1566年）二月，也就是海瑞進京一年半以後，這位「位卑未敢忘憂國」的六品司員，向嘉靖皇帝呈上了《直言天下第一事疏》。海瑞深知當朝的這位皇帝是隻聽得進好話聽不進批評的，因此開宗明義就說一個皇帝是否夠格，關鍵就在於能不能讓臣民知無不言，言無不盡。接下來，他便對嘉靖本人進行誅心剖骨的批評。他指出，如果拿漢文帝劉恆和當今聖上相比，則聖上的「天資英斷」，要遠遠超過漢文帝。然而當今聖上的仁德政績，比起漢文帝來，卻差得很遠。漢文帝創造了歷史上有名的「文景之治」，而當今皇帝創造的，卻是「吏貪官橫，民不聊生，水旱無時，盜賊滋熾」的局面。究其所以，就因為他這個皇帝昏聵多疑（心惑）、剛愎殘忍（苛斷）、自私虛榮（情偏），既是昏君，又是暴君。他還指出，嘉靖不但從政治的角度看不是好皇帝，從倫理的角度看也不是好男人。如果拿君臣、父子、夫婦這「三綱」來衡量一下，就會發現原本應該成為全體臣民道德楷模的皇上，居然一綱都談不上：任意懷疑、謾罵、屠殺臣僚，是不君；對親生兒子毫無教誨養育，連面都不見，是不父；與皇后分居，躲在西苑煉丹，是不夫。難怪普天下的臣民百姓，早就認為他不對了（天下之人不直陛下久矣）！也難怪老百姓要以他的年號來表示對他的不滿，說什麼「嘉靖嘉靖」就是「家家皆淨」（一無所有）了！其實，臣民們的要求並不高，無非希望官府的盤剝輕一點，當局的關懷多一點，冤假錯案少一點，社會風氣正一點。這都是很容易做到的事，「而陛下何不為之」？既然做起來並不困難，那就應該「幡然悔悟，洗數十年之積誤」。事實上，由亂致治，也不過「一振作間而已」，那就請陛下振作起來吧！
這樣的奏疏真是史無前例。正如黃仁宇先生所指出，往常諫臣的批評都是對事，只有海瑞的批評是對人，更不要說還有那咄咄逼人的口氣了！因此此疏一齣，立即引起軒然大波，海瑞的剛直也名震天下，「上自九重，下及薄海，內外無不知有所謂海主事者」。
嘉靖皇帝倒是看完了奏疏的全文。這樣的奏疏他從未見過（也不會有人見過），便是出於好奇也會把它看完。但看完之後的震怒也可想而知。據說他當場把奏摺摔在地下，氣急敗壞地狂喊：馬上把這傢伙抓起來，不要讓他跑了！然而海瑞這一回做的事，實在太了不起了，連太監宮女都被他感動，心中很是有些敬佩。於是宦官黃錦跪下來不慌不忙地奏道：萬歲爺不必動怒。聽說此人向來就有痴名，上疏前就買好了棺材，訣別了家人，安排了後事。這個人是不會逃跑的。嘉靖聽罷，長嘆一聲，又從地上撿起奏本一讀再讀。
據說嘉靖私心也認為海瑞所說是實。他曾多次向首輔sup/sup徐階透露過這個意思。他把海瑞比作殷末的忠臣比干，卻又不肯承認自己是紂王。他承認海瑞說的也有道理，卻又認為自己年老病重，不可能再改了。因此他只有責打宮女來出氣。這樣拖了一段時間後，嘉靖還是下令逮捕了海瑞，交錦衣衛審訊，問成死罪。然而嘉靖又一直不批准海瑞的死刑，只是將他交東廠監禁。十個月後，嘉靖終於死去，成為一個已經知道自己過錯卻又「死不改悔」的皇帝。sup/sup訊息傳來，獄中以酒餚招待海瑞，祝賀他出獄有望，海瑞卻放聲號哭，繼以嘔吐，最後暈倒在地。
新君隆慶皇帝登極以後，海瑞被釋出獄。現在他已成了更大的英雄，其聲望之高，整個帝國無人不曉。他很快就官復原職，又一升再升，其職銜已於前述。事實上不升也是不行的。沒有哪個吏部的官員膽敢反對這位舉國矚目的英雄人物步步高昇，也沒有誰會對他的品行道德提出質疑。這樣，在相當短的時間內，海瑞一步步地升了上去，直至升到應天巡撫，然後因遭彈劾而被迫辭職。
海瑞的第三次罷官完全是他自找的。
依照內閣和吏部的想法，對海瑞的最好的安排，是讓他擔任一種品級較高而實權較小的職務，把他當作一個活化石供在廟堂之上。這樣對大家和他自己都比較合適。sup/sup因為他那種精神固然可嘉，做法卻不可效法，也不宜提倡。如果大家都像他那樣，動不動就直言犯上，提出讓人無法接受的尖銳批評，則朝廷體統何在，官府體面何存？一個開明的君主和時代應該允許人們說話，但這種開明只能是一種裝飾，一種點綴，不能太動真格，而海瑞上書這種事也只可一二，不可再三。再說，像海瑞這樣連皇帝都敢罵的人，放到哪個要害部門都是麻煩。萬一鬧出什麼亂子來，不但大家臉上不好看，對海瑞自己也沒有什麼好處。因此，內閣和吏部的安排，亦無妨看作是對海瑞的保護。
然而海瑞卻不領情，他的責任心和使命感都不允許自己尸位素餐，無所作為。他不理解朝廷為什麼對他表示了足夠的尊敬卻又不給予信任，也不能滿意於在一個又一個體面而又無聊的閒職上耗費光陰。於是，他決定表示抗議。或者說，將內閣一軍。他的機會很好，這一年（西元1569年）正好是所謂「京察之年」。京察是一種對京官的考績制度，這種考績每六年舉行一次，屆時四品以上官員都要做出自我鑑定。海瑞便趁機給皇帝上了一份奏摺，宣稱像他這樣不能為國家做出重大貢獻的官員，其實應予革退，頗有些「當官不為民做主，不如回家賣紅薯」的味道。
內閣和吏部拿這個咬不動、煮不爛、殺不死、嚇不怕又死不開竅的怪人毫無辦法。他們甚至弄不清這個邊遠外省來的書呆子是真天真呢，還是假天真。說他不天真吧，他居然以為只要對他委以重任，憑著他那一身正氣和勇往直前的精神，就能肅清天下流弊，整頓官場頹風。說他天真吧，他似乎又知道以退為進、討價還價的辦法。但不管怎麼說，海瑞這時聲望正隆，沒有人當真膽敢罷黜。既然不能罷黜，那就只能給他一個實缺，任命他為應天巡撫，駐地蘇州。何況，外放也有外放的好處：不在皇上和內閣的眼皮底下，眼不見心不煩，耳朵也要清淨一些。
海瑞決心大幹一場。他要揚善懲惡，移風易俗，做出一個榜樣來。這種先聲奪人的氣勢讓許多貪官汙吏土豪劣紳聞風喪膽。縉紳之家紛紛把朱漆大門改成黑色，以示素樸，弄得蘇州城裡好像家家都在操辦喪事。氣焰囂張的江南織造太監也夾起了尾巴，把自己的轎伕由八人減至四人。但海瑞仍覺得很不過癮，他下令：境內的公文，今後一律使用廉價的紙張。公文後面不許留有空白，以免浪費。他甚至干預官民的私生活，就連佩戴奢華的首飾和嗜吃甜美的零食，也在禁止之列，被禁的專案從忠靖凌雲巾、宛紅撒金紙，一直到鬥糖鬥纏和大定勝餅桌席。這些規定顯然未免失之瑣碎苛細，但海瑞不這麼看。他堅持認為，根據「千里之堤，潰於蟻穴」的原理和「勿以善小而不為，勿以惡小而為之」的準則，在道德風尚方面，所有行為都並無大小之別。再小的善也應褒獎，再小的惡也應遏制。定大局須從做小事入手，因此這些小事也是大事。道德的重建如不能落實到具體的事情上，那就將是空洞的口號。
事實上，海瑞整頓吏治的計劃正是通過一個個可操作的具體規定來實施的。比方說，為了整肅江南士大夫出入官府互通關節的風氣，他規定：凡鄉紳、舉人、監生等到衙門拜見官員，或投遞書信，必須進行登記。登記的內容包括談話的要點和書信的節錄，官員出行則要記載行蹤和言論。凡不讓登記、所記不實或事後篡改者，官員和登記者都要受到處罰。對於過往的官員，海瑞也不客氣，規定他們均應自僱人夫和船隻，地方上只負責補貼費用。而且，如果二等的官坐了一等的船，只給他二等船錢；可坐一條船卻坐了兩條船的，也只給他一條船錢。海瑞認為，這樣既可以使那些逢迎拍馬的人無從下手，也可使那些借出巡之際搜刮民脂民膏的人一無所獲，還可以一正官場的風氣，因此應予堅決地執行。
海瑞雷厲風行地推行他的廉政措施，義無反顧，鬥志昂揚，全中國的官場卻是一片譁然。人們因海瑞的舉措大驚失色，義憤填膺。幾乎所有官員都一致公認從來未見過如此怪僻、乖張、不近情理的封疆大吏，居然視自己的僚屬和過往的官員為寇仇。京師和外地的官員到了海瑞的轄區，如同進入敵國；下屬的官員一舉一動都要登記在冊，簡直形同囚犯。這樣古怪的巡撫，當然無法見容於官場，彈劾的奏章也就不斷地送達御前。給事中舒化的奏章還算客氣，說海瑞早年以風節稱著，不失鯁直之臣，但政令乖謬，「恐非人情」。戴鳳翔的攻擊就要猛烈得多，甚至指控他犯有謀殺罪，因為他的一妻一妾曾在一個晚上同時神秘地死去。儘管海瑞答辯說其妾是八月十四日自縊，其妻則是八月二十五日病亡，並非死於同一天。但日期如此之近，已足以讓人疑竇頓生。何況大家都相信，海瑞的家庭出現悲劇是很自然的，因為他是如此地乖謬怪僻和不近人情。甚至對於海瑞會有這樣的性格大家也不奇怪，因為他原本就是帝國最南端化外之地一個沒見過世面的鄉巴佬，而且還可能是一個少數民族，一個外國人。
內閣和吏部的處置辦法，仍是將海瑞調任閒曹，然而海瑞脾氣之大似乎超過了官場的公憤。他給隆慶皇帝寫了一封信，告誡皇上說：「今舉朝之士皆婦人也，皇上勿聽之可也。」至於他自己，當然更不屑與這些不像男人的傢伙為伍。一氣之下，他跑回海南老家，一去就是十五六年。
明制，中央監察機關為都察院。都察院官員共四級：都御史、都副御史、僉都御史、監察御史。左、右都御史為其最高長官。
黃仁宇：《萬曆十五年》，中華書局1982年版，第138頁。
明代開國不久，朱元璋就取消了宰相職位和宰相制度，首輔則相當於宰相。
嘉靖在其《世宗遺詔》中對自己的過錯幾乎都認了賬。
後來給事中舒化彈劾海瑞時也是這麼說的。他也主張給海瑞安排一個閒曹，「以全地方，亦所以全瑞」（既保全地方，也保全海瑞）。